cSHMT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403678-ACT

SHMT1 umano codifica la serina idrossimetiltransferasi citosolica (cSHMT), un enzima dipendente dal fosfato di piridossale che catalizza la conversione reversibile della serina in glicina, generando al contempo 5,10-metilentetraidrofolato per il metabolismo a un carbonio. cSHMT collega la biosintesi nucleotidica dipendente dai folati con la capacità di metilazione, fornendo unità a un carbonio alla sintesi di timidilato e purine e coordinando un flusso metabolico sensibile allo stato redox. Attraverso il suo ruolo nelle vie folati/un carbonio, SHMT1 influenza la fedeltà della replicazione e della riparazione del DNA, la regolazione epigenetica e le risposte cellulari alla disponibilità di nutrienti. La disregolazione di questo asse è spesso studiata in modelli di stress proliferativo e riprogrammazione metabolica, con implicazioni per fenotipi patologici associati alla stabilità genomica.

cSHMT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SHMT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cSHMT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SHMT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SHMT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cSHMT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SHMT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cSHMT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cSHMT nelle cellule tumorali con espressione di SHMT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.