CRF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400770-ACT

O CRH humano codifica o hormônio liberador de corticotropina (CRF), um neuropeptídeo que inicia o eixo hipotálamo–hipófise–adrenal (HHA) ao estimular a secreção de ACTH por corticotrofos hipofisários e coordenar respostas sistêmicas ao estresse. O CRF sinaliza principalmente por meio de CRHR1/CRHR2, ativando as vias Gs–adenilil ciclase–cAMP–PKA e programas transcricionais a jusante que modulam processos neuroendócrinos, imunes e autonômicos. No cérebro e em tecidos periféricos, o CRH/CRF contribui para a regulação de comportamentos do tipo ansioso, alerta, apetite e do tônus inflamatório por meio de circuitos neuroendócrinos integrados. A expressão e a sinalização desreguladas de CRH têm sido associadas a fenótipos neuropsiquiátricos relacionados ao estresse e a alterações da homeostase endócrina, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos dos circuitos de estresse e de redes gênicas reguladas por hormônios.

CRF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CRF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CRF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CRF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CRF em células tumorais com expressão de CRH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.