CHAC1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-427280-ACT

Chac1 kodiert CHAC1, eine zytosolische γ-Glutamyl-Cyclotransferase, die Glutathion abbaut und das intrazelluläre Redoxgleichgewicht moduliert. CHAC1 wird durch die integrierte Stressantwort (integrated stress response) und die Antwort auf fehlgefaltete Proteine (unfolded protein response) induziert und verknüpft damit ER-Stress-Signale mit der Aminosäureverfügbarkeit, oxidativem Stress und Entscheidungen über das Zellschicksal. Durch die Absenkung der Glutathion-Pools kann CHAC1 ROS-abhängige Signalwege sowie die Empfindlichkeit gegenüber Lipidperoxidationspfaden beeinflussen, einschließlich ferroptoseassoziierter Prozesse. Eine dysregulierte CHAC1-Expression wurde mit zellulären Stressphänotypen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration, Entzündung und die Krebsbiologie relevant sind, wodurch das Mausgen Chac1 ein nützlicher Ansatzpunkt für mechanistische Studien stressadaptiver transkriptioneller Programme ist.

CHAC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Chac1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CHAC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Chac1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Chac1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CHAC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Chac1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CHAC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CHAC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Chac1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.