Cdc25A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400345-ACT

CDC25A codifica a Cdc25A, uma fosfatase de dupla especificidade que ativa quinases dependentes de ciclinas ao remover fosfatos inibitórios, promovendo assim a progressão de G1/S e coordenando a replicação do DNA com o controle por checkpoints. A Cdc25A integra sinais de vias de resposta a danos no DNA, incluindo ATM/ATR–CHK1/CHK2, que regulam sua estabilidade e atividade para restringir a entrada no ciclo celular sob estresse genotóxico. A expressão ou a degradação desreguladas de CDC25A podem comprometer a fidelidade dos checkpoints, aumentar o estresse replicativo e contribuir para a instabilidade genômica observada em distúrbios proliferativos. Como resultado, CDC25A é amplamente estudado na regulação do ciclo celular, no timing de replicação e na remodelação de redes de resposta ao estresse em células humanas.

Cdc25A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDC25A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdc25A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDC25A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDC25A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdc25A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDC25A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdc25A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdc25A em células tumorais com expressão de CDC25A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.