CD8-α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400372-ACT

CD8A codifica o CD8-α, uma glicoproteína transmembranar do tipo I que forma homodímeros CD8αα ou heterodímeros CD8αβ em linfócitos T citotóxicos e em subpopulações de células T com características inatoides. O CD8-α atua como co-receptor da sinalização do TCR restrita ao MHC de classe I ao se ligar ao MHC I e recrutar a LCK para o complexo CD3, amplificando assim a ativação dependente de antígeno, a diferenciação citolítica e a produção de citocinas. Por meio desse papel, CD8A está associado a vias que regulam a formação da sinapse imune, o programa efetor de células T e respostas inflamatórias impulsionadas por interferons. Alterações na expressão de CD8A e nos estados de células T CD8+ são amplamente usadas como indicadores de infiltração imune e disfunção em infecção crônica, autoimunidade e modulação imune associada a tumores.

CD8-α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CD8A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD8-α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CD8A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CD8A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD8-α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CD8A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD8-α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD8-α em células tumorais com expressão de CD8A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.