Plasmide CRISPR d'Activation (m) CD274/PD-L1: sc-425636-ACT

Cd274 code pour CD274/PD-L1, une protéine transmembranaire de type I à fonction immunorégulatrice, qui se lie à PD-1 (Pdcd1) et module la signalisation du récepteur des lymphocytes T afin de limiter la fonction effectrice, la production de cytokines et l’activité cytotoxique. Chez la souris, l’expression de PD-L1 est induite par des signaux inflammatoires tels que l’IFN-γ via la voie JAK/STAT, et elle est modulée par des voies incluant NF-κB et PI3K–AKT, intégrant les réponses immunitaires innée et adaptative. PD-L1 contribue à la tolérance périphérique et à l’homéostasie immunitaire en limitant une activation excessive, tandis qu’une expression altérée dans les tumeurs et les tissus soumis à une inflammation chronique est associée à l’échappement immunitaire et à des états dysfonctionnels des lymphocytes T. Ces caractéristiques font de Cd274 un nœud central pour l’étude de la biologie des points de contrôle immunitaires, des contextes de présentation de l’antigène et du dialogue entre les compartiments stromal, myéloïde et lymphoïde.

CD274/PD-L1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cd274 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD274/PD-L1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cd274 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cd274, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD274/PD-L1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cd274 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD274/PD-L1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD274/PD-L1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cd274 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.