Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCDC111: sc-404310-ACT

PRIMPOL (également appelé CCDC111) code PrimPol, une primase–polymérase qui permet la reprise de la réplication et la tolérance aux dommages de l’ADN lorsque les fourches de réplication rencontrent des lésions ou des structures secondaires de l’ADN. PrimPol favorise le réamorçage en aval des fourches bloquées et contribue au comblement des lacunes post-réplicatives, reliant ainsi son activité à des voies de maintien du génome qui recoupent les réponses au stress réplicatif dépendantes d’ATR. Une altération de la fonction de PRIMPOL a été associée à une augmentation de la mutagenèse et à une sensibilité accrue au stress génotoxique, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la fidélité de la réplication et des réponses cellulaires aux dommages endogènes et exogènes de l’ADN. En tant qu’enzyme nucléaire agissant au niveau de fourches de réplication confrontées à des obstacles, PRIMPOL est fréquemment étudié dans le contexte du stress réplicatif, de la stabilité des fourches et du maintien de l’intégrité chromosomique.

CCDC111 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRIMPOL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCDC111 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRIMPOL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRIMPOL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCDC111. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRIMPOL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCDC111 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCDC111 dans les cellules tumorales présentant une expression de PRIMPOL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.