CAP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405060-ACT

A CAP1 (proteína 1 associada à ciclase) humana é um regulador da ligação a monómeros de actina e do turnover de actina que coopera com a cofilina para promover a remodelação do citoesqueleto. Ao modular a dinâmica da actina, a CAP1 influencia a forma celular, a adesão, a migração e a endocitose, ligando-se a outputs de sinalização das GTPases da família Rho e de vias associadas a adesões focais. A reorganização da actina dependente de CAP1 afeta processos como o tráfego de membranas e a mecanotransdução, frequentemente alterados na biologia tumoral e em fenótipos invasivos. A desregulação da expressão ou da atividade de CAP1 tem sido associada a programas de motilidade aberrantes e a respostas ao stress alteradas em múltiplos contextos celulares relevantes para doenças.

CAP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CAP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CAP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CAP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CAP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CAP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CAP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CAP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CAP1 em células tumorais com expressão de CAP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.