Calpastatin Double Nickaseプラスミド (h): sc-401502-NIC

ヒトのCASTは、カルシウム依存性システインプロテアーゼであるカルパイン1およびカルパイン2に対する内因性かつ高い特異性をもつ阻害因子カラパスタチンをコードしている。カルパインによる限定的なプロテオリシスを抑制することで、カラパスタチンは細胞骨格のリモデリング、フォーカルアドヒージョンのターンオーバー、膜輸送、ならびにCa2+動態やリン酸化カスケードに連動したシグナル伝達事象の制御に寄与する。CASTの活性は、アポトーシス、炎症、神経および筋の恒常性に関与する基質の切断を調節することにより、プロテオスタシスや細胞生存プログラムにも影響を及ぼす。カルパイン—カラパスタチンのバランスの破綻は、神経変性、心血管障害の傷害応答、がん細胞の浸潤に関連する経路と結び付けられており、CASTはCa2+調節性プロテオリシスを研究する上での機構的ハブとして位置付けられる。

Calpastatin ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における CAST 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、CAST内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、CASTの機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、CASTが破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。