CA IV Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404215-ACT

O gene humano CA4 codifica a anidrase carbônica IV (CA IV), uma metaloenzima extracelular ancorada por glicosilfosfatidilinositol (GPI) que catalisa a hidratação reversível do CO₂ em bicarbonato e prótons. Ao acelerar a interconversão CO₂/HCO₃⁻ na superfície celular, a CA IV sustenta a homeostase ácido–base, o transporte iônico epitelial e o manejo de CO₂ em tecidos como rim e pulmão, além de contribuir para a regulação do pH em microambientes moldados pelo metabolismo e pela perfusão. A atividade de CA4 interage com sistemas de transporte de bicarbonato e com processos de sinalização sensíveis ao pH que influenciam a fisiologia celular, incluindo a modulação da função de transportadores e da capacidade tamponante extracelular. A desregulação da atividade das anidrases carbônicas e o controle alterado do pH são relevantes para fenótipos associados a doenças na fisiologia renal e pulmonar e para contextos em que a acidificação extracelular impacta o comportamento celular.

CA IV O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CA4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CA IV O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CA4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CA4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CA IV. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CA4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CA IV no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CA IV em células tumorais com expressão de CA4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.