Plasmide CRISPR d'Activation (h) C12orf48: sc-408897-ACT

PARPBP (C12orf48) code la protéine de liaison à PARP1, un facteur nucléaire qui s’associe à PARP1 et contribue au maintien du génome lors de la réplication de l’ADN. Elle participe à la stabilité des fourches de réplication et à l’efficacité des réponses aux dommages de l’ADN, en reliant les processus de réparation associés à la chromatine à la progression de la phase S. La fonction de PARPBP a été rattachée à des voies qui régulent le stress réplicatif, la signalisation des points de contrôle (checkpoints) et le contrôle du cycle cellulaire. Une expression dérégulée de PARPBP, ou une dépendance accrue à son égard, a été observée dans des contextes d’instabilité génomique, ce qui en fait une cible pertinente pour étudier la fitness des cellules tumorales et les vulnérabilités de réparation de l’ADN dans des modèles cellulaires humains.

C12orf48 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PARPBP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

C12orf48 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PARPBP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PARPBP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de C12orf48. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PARPBP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de C12orf48 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie C12orf48 dans les cellules tumorales présentant une expression de PARPBP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.