Plásmido CRISPR de Activación (h) C11orf65: sc-417466-ACT

C11orf65 (open reading frame 65 del cromosoma 11) codifica una proteína humana poco caracterizada que se ha anotado como un posible factor mitocondrial, con evidencia emergente que la vincula con la homeostasis del orgánulo y la regulación bioenergética. Con base en su localización predicha y su conservación, C11orf65 se investiga a menudo en el contexto de la expresión génica mitocondrial, el soporte de la fosforilación oxidativa y las respuestas al estrés celular que influyen en la reprogramación metabólica. La perturbación de las vías de mantenimiento mitocondrial puede alterar el manejo de especies reactivas de oxígeno y la sensibilidad a la apoptosis, lo que hace que C11orf65 sea de interés en estudios de fenotipos neuromusculares y metabólicos donde se implica disfunción mitocondrial. Dado que las anotaciones funcionales siguen siendo limitadas, la modulación controlada de la expresión endógena de C11orf65 resulta útil para cartografiar consecuencias transcripcionales y proteómicas aguas abajo.

C11orf65 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de C11orf65 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

C11orf65 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus C11orf65 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional C11orf65, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de C11orf65. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo C11orf65 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de C11orf65 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía C11orf65 en células tumorales con expresión de C11orf65 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.