Plásmido CRISPR de Activación (h) BRUNOL4: sc-404263-ACT

CELF4 (BRUNOL4) humano codifica una proteína de unión a ARN de la familia CELF/BRUNO-like que regula el empalme alternativo, la estabilidad del ARNm y la traducción mediante el reconocimiento de elementos ricos en U/G en pre-ARNm y en las UTR 3′. BRUNOL4 contribuye a programas de control génico postranscripcional que moldean la diferenciación neuronal y la expresión génica dependiente de la actividad, influyendo en la función sináptica y en redes de procesamiento de ARN. La desregulación del empalme dependiente de CELF4 y de la homeostasis del ARNm se ha asociado con fenotipos del neurodesarrollo y con mecanismos de enfermedad neurológica, incluidos cambios en la excitabilidad y la susceptibilidad a convulsiones. Estas propiedades hacen de CELF4 una diana útil para desentrañar vías de regulación del ARN y el control de isoformas de transcritos en modelos celulares humanos.

BRUNOL4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CELF4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

BRUNOL4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CELF4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CELF4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de BRUNOL4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CELF4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de BRUNOL4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía BRUNOL4 en células tumorales con expresión de CELF4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.