Plasmide CRISPR d'Activation (h) BRP44L: sc-404976-ACT

Le gène humain **MPC1** code la sous-unité **BRP44L** du transporteur mitochondrial du pyruvate, un complexe clé de la membrane interne qui importe le pyruvate dans la matrice mitochondriale afin d’alimenter le cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs) et la phosphorylation oxydative. En régulant l’équilibre entre la respiration mitochondriale et la glycolyse cytosolique, MPC1 influence l’anaplérose, l’homéostasie redox et le flux de carbone vers les voies biosynthétiques. Une activité altérée de MPC1/BRP44L a été associée au remodelage métabolique observé dans les états prolifératifs ainsi qu’à des phénotypes de dysfonction mitochondriale dans divers systèmes modèles. Par conséquent, MPC1 est fréquemment étudié dans des contextes liés au métabolisme énergétique, à la signalisation mitochondriale et aux voies de détection des nutriments.

BRP44L Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MPC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BRP44L Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MPC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MPC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BRP44L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MPC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BRP44L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BRP44L dans les cellules tumorales présentant une expression de MPC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.