BNIP-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400985-ACT

BNIP3 codifica a BNIP-3, uma proteína BH3-only induzível por hipóxia que se localiza nas mitocôndrias e regula o controlo de qualidade mitocondrial, a mitofagia e as decisões de morte celular. Por meio de interações com membros da família BCL2 e com a maquinaria de autofagia, a BNIP-3 liga a deteção de oxigénio à remodelação da membrana mitocondrial, à adaptação metabólica e à apoptose responsiva ao stress ou à depuração autofágica. A BNIP-3 é controlada transcricionalmente por vias de sinalização de hipóxia, como a HIF-1, e participa nas respostas celulares à isquemia, à privação de nutrientes e ao stress oxidativo. A expressão desregulada de BNIP3 tem sido associada a alterações na biologia tumoral em hipóxia, a respostas ao stress em cardiomiócitos e a processos neurodegenerativos nos quais a disfunção mitocondrial e a mitofagia comprometida contribuem para a patologia.

BNIP-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BNIP3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BNIP-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BNIP3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BNIP3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BNIP-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BNIP3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BNIP-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BNIP-3 em células tumorais com expressão de BNIP3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.