Plasmide CRISPR d'Activation (h) Bestrophin: sc-404183-ACT

Le gène humain BEST1 code la bestrophine-1, un canal anionique activé par le Ca2+, localisé majoritairement sur la membrane basolatérale de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). La bestrophine contribue aux flux de chlorure et de bicarbonate, à l’homéostasie épithéliale des ions et des fluides, ainsi qu’au couplage des signaux intracellulaires de Ca2+ à la conductance membranaire qui soutient les processus de transport transépithélial. L’activité de BEST1 recoupe des voies qui régulent le potentiel de membrane, le volume cellulaire et le métabolisme rétinien, via la modulation des microenvironnements ioniques. Des variations génétiques ou une dérégulation de BEST1 sont associées à des maladies rétiniennes héréditaires, ce qui en fait une cible utile pour étudier la physiologie de l’EPR et les mécanismes de dégénérescence rétinienne dans des modèles cellulaires.

Bestrophin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BEST1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Bestrophin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BEST1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BEST1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Bestrophin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BEST1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Bestrophin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Bestrophin dans les cellules tumorales présentant une expression de BEST1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.