ARHGEF5 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-409563-ACT

ARHGEF5は、RhoファミリーGTPアーゼを活性化するRhoグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）をコードしており、細胞表面受容体からのシグナルをアクチン細胞骨格の再構築へとつなぎます。RhoA駆動性経路の制御を介して、ARHGEF5は細胞接着、極性、運動性に影響し、フォーカルアドヒージョンのダイナミクスやストレスファイバー形成にも寄与します。このシグナル軸は増殖や生存を制御する経路とも連結しているため、ARHGEF5は細胞骨格制御とシグナル伝達を研究するうえで有用な結節点となります。Rho GTPアーゼ制御の異常は、浸潤性表現型や異常な組織構築と関連することが報告されており、移動や増殖の破綻が関与する疾患関連モデルにおいてARHGEF5を検討する意義を支持します。

ARHGEF5 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ARHGEF5の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

ARHGEF5 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ARHGEF5 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はARHGEF5転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性ARHGEF5の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のARHGEF5遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるARHGEF5依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびARHGEF5発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるARHGEF5経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。