Plasmide CRISPR d'Activation (h) Apaf-1: sc-401291-ACT

APAF1 code le facteur d’activation des protéases apoptotiques 1 (Apaf-1), une protéine échafaudage centrale de la voie intrinsèque mitochondriale de l’apoptose. Après la libération du cytochrome c et la liaison du dATP/ATP, Apaf-1 s’oligomérise en apoptosome afin de recruter et d’activer la caspase initiatrice-9, entraînant des cascades de caspases en aval qui régulent la mort cellulaire programmée. Ce nœud intègre les signaux de stress cellulaire, la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale et les voies de contrôle (« checkpoints ») qui gouvernent l’homéostasie tissulaire et le renouvellement cellulaire au cours du développement. Une activité dérégulée d’APAF1 a été associée à une compétence apoptotique altérée dans le contexte de la biologie des cancers et de modèles liés à la neurodégénérescence, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques du contrôle du destin cellulaire.

Apaf-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de APAF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Apaf-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus APAF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription APAF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Apaf-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus APAF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Apaf-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Apaf-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de APAF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.