Plasmide CRISPR d'Activation (m) AP-3β: sc-419135-ACT

Ap3b1 code pour la sous-unité bêta du complexe adaptateur 3 (AP‑3β), un composant clé du trafic associé à la clathrine qui assure le tri de cargos transmembranaires depuis les endosomes vers les lysosomes et les organites apparentés aux lysosomes. Dans les cellules de souris, les voies dépendantes d’AP‑3 soutiennent la biogenèse régulée des vésicules, la localisation des protéines membranaires et l’acheminement de cargos, autant de fonctions essentielles à l’homéostasie endolysosomale et aux compartiments sécrétoires spécialisés. La perturbation de la fonction du complexe AP‑3 est associée à des défauts de transport intracellulaire et de maturation des organites, des processus qui recoupent la biologie des granules des cellules immunitaires et la protéostase neuronale. Ainsi, Ap3b1 est fréquemment étudié dans des modèles de dysfonction du trafic vésiculaire, de phénotypes liés à la pigmentation et aux granules, ainsi que de mécanismes neuro‑immuns impliquant des organites apparentés aux lysosomes.

AP-3β Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ap3b1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AP-3β Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ap3b1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ap3b1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AP-3β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ap3b1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AP-3β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AP-3β dans les cellules tumorales présentant une expression de Ap3b1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.