ALR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403367-ACT

O GFER humano codifica o augmenter of liver regeneration (ALR), uma oxidase de sulfidrilas dependente de FAD, localizada principalmente no espaço intermembranar mitocondrial, onde dá suporte ao dobramento oxidativo de proteínas por meio do sistema de importação MIA40/CHCHD4. Ao regular a formação de pontes dissulfeto e a homeostase redox, o ALR contribui para a biogênese mitocondrial, o funcionamento da cadeia respiratória e as respostas celulares ao estresse. Alterações em GFER têm sido associadas a fenótipos de disfunção mitocondrial e a distúrbios multissistêmicos que afetam tecidos com alta demanda energética, tornando-o relevante para o estudo de sinalização regulada por redox, proteostase e controle de qualidade de organelas.

ALR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GFER sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GFER em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GFER, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GFER nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALR em células tumorais com expressão de GFER silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.