AKAP 2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-419065-ACT-2

O gene Akap2 de camundongo codifica a proteína de ancoragem da A-quinase 2 (AKAP2), um arcabouço que organiza espacialmente a proteína quinase A (PKA) e componentes de sinalização associados para conferir respostas ao AMPc específicas de compartimento. Ao recrutar a PKA para locais subcelulares definidos, a AKAP2 influencia redes de fosforilação que regulam a dinâmica do citoesqueleto, a polaridade celular, o tráfego de membranas e programas transcricionais dependentes do contexto a jusante da sinalização por AMPc. A desorganização ou a regulação alterada de microdomínios de PKA ancorados por AKAP é relevante para estudos de sinalização do desenvolvimento, da excitabilidade de neurônios e cardiomiócitos e de mecanismos mais amplos de desregulação de sinalização implicados em fenótipos associados a doenças. Fluxos de trabalho de edição gênica e genômica funcional do Akap2 permitem investigar a compartimentalização da PKA, mapear interfaces de interação proteína–proteína e validar readouts celulares dependentes de vias em modelos de camundongo e sistemas celulares engenheirados.

AKAP 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Akap2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AKAP 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Akap2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Akap2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AKAP 2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Akap2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AKAP 2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AKAP 2 em células tumorais com expressão de Akap2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.