AIP5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403772-ACT

WWP1 codifica a ligase E3 de ubiquitina-proteína humana AIP5, um membro da família NEDD4 do tipo HECT que regula o turnover de proteínas e a amplitude de sinalização por meio da ubiquitinação de componentes das vias. Ao moldar o tráfego dependente de ubiquitina e a proteostase, a AIP5 pode influenciar programas celulares como a sinalização por fatores de crescimento, respostas ao estresse e resultados transcricionais. Alterações na atividade de WWP1 têm sido associadas a redes de sinalização desreguladas e a desequilíbrios na via da ubiquitina observados em múltiplos contextos de doença, tornando-o um nó útil para estudar o redirecionamento de vias. Na pesquisa biomédica, a modulação da expressão de AIP5 ajuda a investigar como a ubiquitinação controla a dinâmica de receptores, a duração do sinal e os estados de expressão gênica a jusante.

AIP5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de WWP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AIP5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus WWP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição WWP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AIP5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus WWP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AIP5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AIP5 em células tumorais com expressão de WWP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.