Adenylate cyclase 2/AC2/ADCY2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402994-ACT

Il gene umano **ADCY2** codifica l’adenilato ciclasi 2 (AC2), un enzima associato alla membrana che converte l’ATP in AMP ciclico (cAMP) in risposta alla segnalazione mediata dai recettori accoppiati a proteine G, in particolare tramite l’input stimolatorio di Gαs e quello modulatore di Gβγ. Modulando i livelli intracellulari di cAMP, AC2 regola programmi di fosforilazione dipendenti da PKA ed EPAC che influenzano l’attività dei canali ionici, il rilascio di neurotrasmettitori, le risposte metaboliche e output trascrizionali come la segnalazione di CREB. L’attività di ADCY2 è quindi parte integrante dell’integrazione dei segnali alla membrana plasmatica e della dinamica temporale della propagazione dei secondi messaggeri in cellule eccitabili e non eccitabili. Studi genetici e funzionali hanno collegato un’alterata regolazione della via del cAMP che coinvolge ADCY2 a fenotipi neuropsichiatrici e comportamentali, supportandone la rilevanza per studi meccanicistici della segnalazione neuronale e dell’omeostasi cellulare.

Adenylate cyclase 2/AC2/ADCY2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADCY2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Adenylate cyclase 2/AC2/ADCY2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADCY2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADCY2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Adenylate cyclase 2/AC2/ADCY2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADCY2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Adenylate cyclase 2/AC2/ADCY2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Adenylate cyclase 2/AC2/ADCY2 nelle cellule tumorali con espressione di ADCY2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.