ADAR3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402742-ACT

ADARB2 codifica a ADAR3, uma adenosina desaminase que atua sobre RNA, enriquecida em neurônios, que se liga a RNA de dupla fita e está associada à regulação da dinâmica de edição de RNA no sistema nervoso. No âmbito da regulação gênica pós-transcricional, a edição de RNA A-to-I (adenosina para inosina) influencia a estabilidade dos transcritos, o splicing alternativo, o direcionamento por miRNAs e o potencial codificante, moldando assim a sinalização sináptica e a excitabilidade neuronal. Embora a ADAR3 seja geralmente considerada com atividade catalítica limitada em comparação com ADAR1/ADAR2, ela pode modular o acesso aos substratos de RNA e é estudada no contexto da biologia de doenças do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricas. Alterações nos perfis de edição de RNA associadas à atividade da família ADAR foram relatadas em diversos distúrbios neurológicos e em tumores cerebrais, o que motiva estudos mecanísticos da regulação de RNA dependente de ADAR3 em células humanas.

ADAR3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADARB2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ADAR3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADARB2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADARB2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ADAR3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADARB2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ADAR3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ADAR3 em células tumorais com expressão de ADARB2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.