Plásmido CRISPR de Activación (h) ACAP1: sc-405104-ACT

ACAP1 (ArfGAP con dominios de hélice enrollada, repeticiones de anquirina y PH 1) codifica una proteína activadora de GTPasa regulada por ARF6 que acopla la unión a fosfoinosítidos con eventos de tráfico de membranas. ACAP1 participa en el reciclaje endocítico asociado a clatrina, ayudando a controlar la clasificación de la carga y el retorno de receptores y moléculas de adhesión a la membrana plasmática, influyendo así en la polaridad celular, la migración y la dinámica de señalización. A través de sus funciones en endosomas de reciclaje y en el tráfico vinculado a actina, ACAP1 es relevante para vías que regulan el recambio de receptores, la adhesión dependiente de integrinas y la remodelación de membranas en células inmunitarias. La desregulación del reciclaje endosomal y de la actividad de la red de ARF6 se ha implicado en la señalización oncogénica, fenotipos asociados a la invasión y disfunción inmunitaria, lo que convierte a ACAP1 en un nodo útil para estudios mecanísticos de la regulación dependiente del tráfico.

ACAP1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ACAP1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ACAP1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ACAP1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ACAP1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ACAP1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ACAP1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ACAP1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ACAP1 en células tumorales con expresión de ACAP1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.