βENaC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401371-ACT

SCNN1B codifica a subunidade β do canal epitelial de sódio (βENaC), um componente central do transporte de Na⁺ sensível à amilorida através das membranas apicais em tecidos epiteliais. Em conjunto com as subunidades α e γ, o βENaC sustenta a reabsorção de sódio e a homeostase de fluidos, conectando o transporte iónico à função de barreira epitelial e a vias de regulação do volume. A atividade do ENaC integra-se com processamento proteolítico, tráfego dependente de ubiquitina (incluindo regulação mediada por NEDD4L) e sinalização responsiva a hormonas, que ajusta a abundância do canal e a probabilidade de estar aberto. Alterações na expressão ou função de SCNN1B têm sido associadas a perturbações do manuseio de sal e da regulação do líquido de superfície das vias aéreas, tornando-o relevante para estudos de fisiologia epitelial e de fenótipos de transporte iónico associados a doenças.

βENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SCNN1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

βENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SCNN1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SCNN1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de βENaC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SCNN1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de βENaC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via βENaC em células tumorais com expressão de SCNN1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.