YAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400040-ACT

Das humane YAP1-Gen kodiert das Yes-associated Protein (YAP), einen transkriptionellen Koaktivator, der als zentraler Effektor des Hippo-Signalwegs wirkt und die Kontrolle der Organgröße, die Mechanotransduktion sowie die Homöostase von Epithelgeweben koordiniert. Ist die Hippo-Signalisierung inaktiv, reichert sich YAP im Zellkern an und bildet mit Transkriptionsfaktoren der TEAD-Familie Komplexe, um Genprogramme zu regulieren, die Zellzyklusprogression, Überleben und Umbau der extrazellulären Matrix steuern. Die YAP-Aktivität integriert Signale aus Zelldichte, Polaritätskomplexen, GPCR-Signalisierung und der Spannung des Aktin-Zytoskeletts und verknüpft so Kräfte aus dem Mikroumfeld mit transkriptionellen Outputs. Eine fehlregulierte YAP-Signalisierung wird in zahlreichen Forschungszusammenhängen zu Krebs und Fibrose mit abweichender Wachstumskontrolle und veränderten Differenzierungszuständen in Verbindung gebracht.

YAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen YAP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

YAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des YAP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der YAP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen YAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native YAP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von YAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des YAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem YAP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.