XPF CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401692-ACT

ERCC4は、ヒトの構造特異的エンドヌクレアーゼXPFをコードしており、ERCC1とヘテロ二量体を形成してヌクレオチド除去修復（NER）における5′側の切断を担うほか、ファンコニ貧血（FA）／相同組換え（HR）ネットワークを介したDNA鎖間クロスリンクの処理にも関与します。XPFは分岐したDNA構造を認識し、複製停止フォークの解消にも寄与することで、内因性ストレスおよび遺伝毒性ストレス下でゲノム安定性を維持します。ERCC4／XPF機能の破綻は、色素性乾皮症やそれに関連する早老様表現型など、DNA修復欠損症候群と関連し、損傷除去不全と変異負荷の増大を介して発がん研究の観点からも重要です。このためERCC4は、紫外線損傷応答、クロスリンク修復、複製ストレス、チェックポイントシグナル伝達のモデルにおいて頻繁に解析対象となっています。

XPF CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ERCC4の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

XPF CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ERCC4 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はERCC4転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性XPFの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のERCC4遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるXPF依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびERCC4発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるXPF経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。