Wnt-5b CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-402157-ACT-2

Das humane WNT5B-Gen kodiert den sezernierten Liganden Wnt-5b, einen zentralen Vermittler der β-Catenin-unabhängigen (nicht-kanonischen) Wnt-Signalübertragung, der über Signalwege wie die planare Zellpolarisierung (PCP) und die Wnt/Ca²⁺-Signalgebung die Zellpolarität, gerichtete Migration und den Umbau des Zytoskeletts reguliert. Wnt-5b bindet an Frizzled-Rezeptoren und Korezeptoren (einschließlich Proteinen der ROR-Familie) und moduliert nachgeschaltete Effektoren, die die Gewebemorphogenese, die mesenchymale Differenzierung sowie das Cross-Talk mit entzündlichen Signalwegen prägen. Eine veränderte WNT5B-Expression oder -Signalgebung wurde mit fehlregulierten Entwicklungsprogrammen in Verbindung gebracht und wird häufig in Kontexten wie der Invasivität von Tumorzellen, der metabolischen und adipogenen Regulation sowie fibrotischem Remodeling untersucht. Die Geneditierung von WNT5B ermöglicht mechanistische Studien zur ligandspezifischen Verschaltung von Wnt-Netzwerken, zur Rezeptornutzung sowie zu transkriptionellen und phänotypischen Ergebnissen in gentechnisch erzeugten Zellmodellen und Organoid-Systemen.

Wnt-5b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WNT5B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wnt-5b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WNT5B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WNT5B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wnt-5b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WNT5B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wnt-5b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wnt-5b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WNT5B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.