Wee 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423702-ACT

Wee1 codifica a quinase proteica WEE1, um regulador conservado do checkpoint de dano ao DNA em G2/M que restringe a entrada em mitose por fosforilação inibitória de CDK1, coordenando a conclusão da fase S, as respostas ao estresse replicativo e a integridade do genoma. Em células de camundongo, a WEE1 integra sinais de ATR/CHK1 e de outras vias de checkpoint para modular o timing do ciclo celular, estabilizar forquilhas de replicação estagnadas e limitar o acúmulo de quebras de dupla fita no DNA. A perturbação da atividade de Wee1 altera a proliferação, a estabilidade cromossômica e programas de apoptose, tornando-a um nó amplamente utilizado para estudar estresse replicativo, adaptação de checkpoints e fenótipos do tipo catástrofe mitótica. A sinalização desregulada de WEE1 é frequentemente investigada no contexto de aceleração do ciclo celular induzida por oncogenes e de dependências de vias de reparo de DNA, sustentando pesquisas mecanísticas em biologia do câncer e manutenção do genoma.

Wee 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Wee1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Wee 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Wee1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Wee1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Wee 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Wee1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Wee 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Wee 1 em células tumorais com expressão de Wee1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.