Villin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400587-ACT

VIL1はビリン（villin）をコードしており、ビリンはアクチン結合およびアクチン切断活性をもつタンパク質で、腸管および腎臓の上皮微絨毛に豊富に存在し、頂端側ブラッシュボーダーの形成と再構築を助けます。ビリンは、Ca²⁺依存的にFアクチンの束化と切断を制御することで細胞骨格の構築、上皮の極性、細胞運動性を調節し、膜動態を吸収上皮における分化プログラムと結び付けます。腸上皮細胞系譜の代表的マーカーとして、VIL1の発現変化は、炎症、損傷応答、腫瘍化に伴う上皮状態の変化を追跡する指標としてしばしば用いられます。これらの特性により、ビリンはヒト上皮モデルにおいて微絨毛構築、バリア機能、生体骨格依存的シグナル伝達を研究するための有用な切り口となります。

Villin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性VIL1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Villin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における VIL1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はVIL1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Villinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のVIL1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるVillin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびVIL1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるVillin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。