Tyrosinase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400255-ACT

O gene TYR humano codifica a tirosinase, uma oxidase dependente de cobre que catalisa as etapas limitantes da taxa da melanogênese ao converter L-tirosina em L-DOPA e DOPAquinona, impulsionando, ao final, a síntese de eumelanina e feomelanina nos melanossomos. A atividade de TYR integra-se a programas de biogênese e tráfego de melanossomos e é coordenada com redes transcricionais específicas de células pigmentares, influenciando o equilíbrio redox celular e vias de estresse responsivas à radiação UV. Alterações na função de TYR estão associadas a fenótipos de pigmentação e a distúrbios relacionados à melanina, e TYR é frequentemente utilizado como leitura molecular da diferenciação de melanócitos e da maturação de melanossomos. Como enzima restrita a uma linhagem celular, a tirosinase também serve como um modelo útil para estudar enzimologia específica de organelas e secreção regulada em células pigmentares.

Tyrosinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TYR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tyrosinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TYR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TYR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tyrosinase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TYR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tyrosinase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tyrosinase em células tumorais com expressão de TYR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.