tuberin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400683-ACT

O TSC2 humano codifica a tuberina, um supressor tumoral que forma um complexo funcional com a hamartina (TSC1) para atuar como uma GAP para o RHEB e restringir a sinalização do mTORC1. Ao integrar sinais das vias PI3K–AKT, AMPK e MAPK, a tuberina coordena a detecção de nutrientes, a síntese proteica, a autofagia e o controle do crescimento celular. A perda ou atenuação da função de TSC2 perturba programas metabólicos e translacionais dependentes de mTOR e altera a dinâmica de sinalização associada aos lisossomos. A desregulação do eixo TSC1/TSC2–RHEB–mTOR está fortemente ligada ao complexo de esclerose tuberosa e a mTORopatias relacionadas, oferecendo uma estrutura central para estudos mecanísticos do controle do crescimento e da homeostase celular.

tuberin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TSC2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

tuberin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TSC2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TSC2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de tuberin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TSC2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de tuberin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via tuberin em células tumorais com expressão de TSC2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.