TRC8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-429220-ACT

Rnf139 codifica TRC8, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING finger residente no retículo endoplasmático, implicada na renovação proteica dependente de ubiquitina e na degradação associada ao RE (ERAD). Ao acoplar a ubiquitinação à eliminação pelo proteassoma, a TRC8 contribui para a proteostase e pode influenciar processos regulados por lipídios e esteróis por meio de interações com reguladores de sinalização e do metabolismo associados à membrana. Alterações na atividade da TRC8 têm sido relacionadas a desregulação do controle de crescimento e a respostas ao estresse celular, tornando o Rnf139 um nó útil para estudar a sinalização por ubiquitina em vias relevantes para a estabilidade do genoma, a homeostase metabólica e a transformação oncogênica. Em modelos murinos, a modulação da expressão de Rnf139 dá suporte a estudos mecanísticos de proteostase específica de tecido e de reprogramação de sinalização.

TRC8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Rnf139 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRC8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Rnf139 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Rnf139, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRC8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Rnf139 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRC8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRC8 em células tumorais com expressão de Rnf139 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.