TRADD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401177-ACT

Humanes TRADD (TNFRSF1A-associated via death domain) ist ein Adapterprotein, das den aktivierten TNF-Rezeptor 1 mit nachgeschalteten Signalkomplexen koppelt, die entzündliche Transkription und Entscheidungen über das Zellschicksal steuern. Über Interaktionen seiner Death Domain ist TRADD an der Assemblierung rezeptornaher Komplexe beteiligt, die die kanonischen NF-κB- und MAPK-Signalwege regulieren, und kann je nach zellulärem Kontext auch die caspaseabhängige apoptotische Signalübertragung beeinflussen. TRADD-vermittelte Signalgebung prägt angeborene Immunantworten, die Zytokinproduktion und Stressantworten und ist damit relevant für Studien zu chronischer Entzündung, Immundysregulation und Mechanismen des Tumorzellüberlebens. Eine veränderte Aktivität der TNF/TRADD-Achse wurde mit vielfältigen krankheitsassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, bei denen NF-κB-getriebene Transkription und Death-Receptor-Signalgebung gestört sind.

TRADD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRADD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRADD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRADD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRADD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRADD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRADD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRADD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRADD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRADD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.