TNAP CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400784-ACT

ALPLは組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）をコードしており、TNAPはグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型の細胞外酵素として、細胞外のリン酸モノエステルを加水分解し、無機リン酸／ピロリン酸のバランスを調節する。TNAPはピロリン酸の利用可能量を制御し、さらにハイドロキシアパタイト形成に必要なリン酸を供給することで、石灰化プログラムおよび骨芽細胞分化の中核的な制御因子となる。また、ATPなどのヌクレオチド代謝を介してプリン作動性シグナル伝達とも連関する。TNAP活性は、骨および血管組織における細胞外マトリックスの組成や石灰化の起こりやすさにも影響する。ALPL/TNAP機能の破綻は異常なミネラル沈着や骨格表現型と関連しており、骨生物学、石灰化経路、リン酸恒常性の研究において重要である。

TNAP CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ALPLの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

TNAP CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ALPL 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はALPL転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性TNAPの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のALPL遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるTNAP依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびALPL発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるTNAP経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。