TMEM214 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-427183-ACT-2

O gene Tmem214 de camundongo codifica a TMEM214, uma proteína transmembrana associada ao retículo endoplasmático implicada na regulação da apoptose e na sinalização do estresse do RE; a TMEM214 tem sido associada à modulação da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) e da homeostase de Ca2+, influenciando decisões de sobrevivência celular sob estresse proteotóxico e perturbações da função do RE; a desregulação do estresse do RE e das vias apoptóticas é relevante para mecanismos estudados em neurodegeneração, disfunção metabólica e biologia do câncer, tornando o Tmem214 um alvo útil para dissecar essas vias; a edição gênica de Tmem214 em células murinas ou em modelos in vivo permite a investigação funcional da interconexão entre estresse do RE e apoptose, de programas transcricionais a jusante e de fenótipos adaptativos ao estresse na pesquisa biomédica.

TMEM214 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tmem214 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TMEM214 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tmem214 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tmem214, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TMEM214. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tmem214 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TMEM214 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TMEM214 em células tumorais com expressão de Tmem214 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.