TMEM192 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-415021-ACT

O gene humano TMEM192 codifica uma proteína transmembrana associada a lisossomos, implicada na organização endolisossomal e no tráfego vesicular. A sua localização nas membranas lisossomais sustenta funções na integridade do lisossomo, no processamento de cargas e na coordenação das vias de autofagia–lisossomo que mantêm a proteostase celular. Como a função lisossomal influencia a sinalização imune inata, a adaptação metabólica e as respostas ao stress, alterações na atividade de TMEM192 são relevantes para pesquisas sobre neurodegeneração, sobrevivência de células tumorais e fenótipos inflamatórios, nos quais processos dependentes de lisossomos são frequentemente perturbados. A modulação da expressão de TMEM192 oferece uma abordagem viável para investigar a regulação, centrada no lisossomo, das vias de degradação e a comunicação cruzada entre vias de sinalização.

TMEM192 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TMEM192 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TMEM192 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TMEM192 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TMEM192, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TMEM192. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TMEM192 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TMEM192 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TMEM192 em células tumorais com expressão de TMEM192 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.