Thrombospondin 5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419759-ACT

Comp codifica a trombospondina 5 (proteína oligomérica da matriz da cartilagem, COMP), uma glicoproteína secretada da matriz extracelular, enriquecida em cartilagem e tendão, que dá suporte à montagem da matriz e à integridade mecânica do tecido. A trombospondina 5 participa da fibrilogênese do colágeno e da organização da matriz extracelular e influencia interações célula–matriz que moldam a diferenciação de condrócitos e o desenvolvimento esquelético. A alteração da expressão de COMP ou o seu mau dobramento (misfolding) está associada à disfunção da placa de crescimento, a respostas de estresse do retículo endoplasmático e à remodelação da cartilagem relacionada à degeneração. Em modelos murinos, Comp é amplamente utilizado para estudar a homeostase da matriz extracelular, a mecanobiologia e vias que contribuem para a patologia da cartilagem e fenótipos do tecido conjuntivo.

Thrombospondin 5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Comp sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Thrombospondin 5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Comp em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Comp, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Thrombospondin 5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Comp nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Thrombospondin 5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Thrombospondin 5 em células tumorais com expressão de Comp silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.