TFEB Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-437332-ACT

O gene Tfeb de camundongo codifica o fator de transcrição EB (TFEB), um regulador do tipo hélice–alça–hélice básica com zíper de leucina que coordena a biogênese lisossomal e a autofagia por meio da rede gênica CLEAR. O TFEB integra sinais de nutrientes e de estresse a jusante do mTORC1 e de vias de quinases relacionadas para controlar a função lisossomal, o tráfego endolisossomal e a proteostase celular. Alterações na atividade do TFEB têm sido associadas à desregulação das vias de autofagia–lisossomo implicadas em neurodegeneração, disfunção metabólica e fenótipos semelhantes a doenças de armazenamento lisossomal, tornando-o um nó central para estudos mecanísticos de programas celulares de depuração.

TFEB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tfeb sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TFEB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tfeb em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tfeb, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TFEB. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tfeb nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TFEB no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TFEB em células tumorais com expressão de Tfeb silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.