TEF-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423326-ACT

Maus-Tead1 kodiert den Transkriptionsfaktor TEF‑1, ein DNA-bindendes Protein mit TEA/ATTS-Domäne, das mit den Koaktivatoren YAP/TAZ zusammenwirkt, um Enhancer-Aktivität und Genexpressionsprogramme zu regulieren, die Proliferation, Überleben und Linienspezifizierung steuern. TEF‑1 ist ein zentraler Effektor des Hippo-Signalwegs und integriert mechanische Reize, Zell‑Zell‑Kontakt und Signale der extrazellulären Matrix, um Gewebewachstum und Organgröße zu formen. Während der Entwicklung und in der Homöostase des adulten Organismus beeinflusst TEF‑1 Gen-Netzwerke in Kardiomyozyten und der Skelettmuskulatur ebenso wie die epitheliale Regeneration sowie Stamm-/Vorläuferzellzustände. Fehlregulierte TEAD-abhängige Transkription wird häufig im Zusammenhang mit gestörter Wachstumskontrolle sowie fibrotischen oder onkogenen Transkriptionsprogrammen untersucht, wodurch Tead1 ein nützlicher Knotenpunkt für die Analyse von Signalwegen in Mausmodellen ist.

TEF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tead1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TEF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tead1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tead1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TEF-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tead1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TEF-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TEF-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tead1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.