SURF-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423221-ACT

Surf4 codifica a SURF-4, uma proteína de membrana do retículo endoplasmático (RE) evolutivamente conservada, implicada na função inicial da via secretora e no tráfego do RE para o complexo de Golgi. A SURF-4 participa de mecanismos de seleção e retenção de carga que ajudam a coordenar a triagem de proteínas, a secreção e a proteostase — processos intimamente ligados às respostas ao estresse do RE. Alterações no tráfego secretor e na homeostase do RE são amplamente relevantes para desregulação metabólica, inflamação e fenótipos neurodegenerativos em sistemas modelo, tornando Surf4 um alvo útil para estudar como a carga biossintética influencia a fisiologia celular. Em pesquisas com camundongos, a modulação de Surf4 dá suporte a investigações do controle da via secretora em hepatócitos, células imunes e outros tecidos com alta demanda secretória.

SURF-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Surf4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SURF-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Surf4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Surf4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SURF-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Surf4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SURF-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SURF-4 em células tumorais com expressão de Surf4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.