SPRED2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-431133-ACT

Spred2 codifica a SPRED2, uma proteína adaptadora relacionada às Sprouty que regula negativamente a sinalização de receptores tirosina-quinase ao restringir a cascata RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK. Por meio de interações com RAF e com complexos de sinalização associados, a SPRED2 ajuda a modular respostas induzidas por fatores de crescimento, como proliferação, diferenciação, migração e expressão de genes inflamatórios. Em sistemas murinos, alterações na atividade de SPRED2 têm sido associadas a dinâmicas desreguladas da sinalização MAPK e a mudanças subsequentes na homeostase imune e tecidual. Como um “freio” da via, a SPRED2 é frequentemente estudada em contextos nos quais a amplitude e a duração da sinalização de ERK influenciam fenótipos relevantes para modelos de transformação oncogênica, biologia vascular e patologias associadas à inflamação.

SPRED2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Spred2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPRED2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Spred2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Spred2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPRED2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Spred2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPRED2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPRED2 em células tumorais com expressão de Spred2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.