SPP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405271-ACT

HM13 codifica a peptidase de peptídeo sinal (SPP), uma protease aspártica intramembranar localizada no retículo endoplasmático que cliva peptídeos sinal remanescentes após o processamento pela peptidase de sinal. Ao mediar a proteólise intramembranar regulada, a SPP contribui para a renovação de proteínas de membrana, a geração de fragmentos peptídicos e a coordenação do controle de qualidade de proteínas no RE e da homeostase da via secretória. A atividade da SPP se cruza com programas de proteostase, como a degradação associada ao RE, e pode influenciar a disponibilidade de peptídeos antigênicos para a vigilância imune por meio do processamento de substratos derivados de peptídeos sinal. A desregulação dessas vias é relevante para a adaptação ao estresse celular e para mecanismos relacionados ao sistema imune, frequentemente perturbados em contextos de doenças complexas.

SPP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HM13 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HM13 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HM13, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HM13 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPP em células tumorais com expressão de HM13 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.