spectrin β I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402738-ACT

SPTB codifica a espectrina βI, um componente central do citoesqueleto da membrana do eritrócito, que forma heterotetrâmeros com a α-espectrina para sustentar a estabilidade da membrana plasmática, a elasticidade e o formato bicôncavo. Por meio do acoplamento a complexos de actina e anquirina, a espectrina βI ajuda a organizar microdomínios de membrana e coordena a resiliência mecânica durante deformações repetidas na microcirculação. A desorganização da arquitetura citoesquelética dependente de SPTB compromete a integridade das hemácias, favorecendo morfologia alterada e maior fragilidade. Variações genéticas em SPTB estão associadas a anemias hemolíticas hereditárias, incluindo a esferocitose hereditária e distúrbios relacionados da membrana eritrocitária, tornando-o um alvo útil para estudar mecânica do citoesqueleto e homeostase da membrana.

spectrin β I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPTB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

spectrin β I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPTB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPTB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de spectrin β I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPTB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de spectrin β I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via spectrin β I em células tumorais com expressão de SPTB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.