Plásmido CRISPR de Activación (h) SPATA18: sc-407015-ACT

El gen humano SPATA18 codifica un factor asociado a las mitocondrias implicado en el control de calidad mitocondrial y en la eliminación, sensible al estrés, de mitocondrias dañadas mediante procesos similares a la mitofagia. Se ha vinculado a las respuestas celulares al estrés oxidativo y al mantenimiento de la integridad de la membrana mitocondrial, conectando la actividad de SPATA18 con vías más amplias que regulan el metabolismo energético, la homeostasis de las especies reactivas de oxígeno y el recambio de orgánulos. Se ha informado de una regulación alterada de SPATA18 en contextos de estrés celular y de programas de mantenimiento del genoma, lo que lo hace relevante para estudios sobre disfunción mitocondrial y fenotipos asociados a la proliferación. Estas funciones sitúan a SPATA18 como un nodo útil para investigar cómo la vigilancia mitocondrial se integra con decisiones sobre el destino celular y con la remodelación metabólica asociada a enfermedades.

SPATA18 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SPATA18 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SPATA18 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SPATA18 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SPATA18, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SPATA18. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SPATA18 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SPATA18 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SPATA18 en células tumorales con expresión de SPATA18 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.