SPATA18 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407015-ACT

O SPATA18 humano codifica um fator associado às mitocôndrias, implicado no controlo de qualidade mitocondrial e na remoção, responsiva ao stress, de mitocôndrias danificadas por processos do tipo mitofagia. Está ligado às respostas celulares ao stress oxidativo e à manutenção da integridade da membrana mitocondrial, conectando a atividade do SPATA18 a vias mais amplas que regulam o metabolismo energético, a homeostase de espécies reativas de oxigénio e a renovação de organelos. Foi descrita uma regulação alterada do SPATA18 em contextos de stress celular e de programas de manutenção do genoma, tornando-o relevante para estudos de disfunção mitocondrial e de fenótipos associados à proliferação. Estas funções posicionam o SPATA18 como um nodo útil para investigar como a vigilância mitocondrial se articula com decisões de destino celular e com a remodelação metabólica associada a doenças.

SPATA18 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPATA18 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPATA18 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPATA18 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPATA18, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPATA18. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPATA18 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPATA18 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPATA18 em células tumorais com expressão de SPATA18 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.