SPA-L3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-411666-ACT

O SIPA1L3 humano codifica a SPA-L3, uma proteína de suporte (scaffold) de sinalização multidomínios que interage com redes regulatórias de pequenas GTPases e organiza complexos proteicos na membrana plasmática e no citoesqueleto cortical. Por meio de sua associação com componentes das vias Rap/Ras e com complexos ligados à actina, a SPA-L3 está posicionada para influenciar a polaridade celular, a adesão e a remodelação dinâmica do citoesqueleto que moldam a migração e a morfogênese. A regulação alterada desses processos é frequentemente implicada em comportamento invasivo e arquitetura tecidual aberrante, tornando o SIPA1L3 um locus útil para estudar o redirecionamento de vias em estados celulares relevantes para doenças. Assim, a expressão de SIPA1L3 e a conectividade de sua rede são informativas em modelos que investigam a sinalização próxima à membrana, o controle do citoesqueleto e a plasticidade fenotípica.

SPA-L3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SIPA1L3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPA-L3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SIPA1L3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SIPA1L3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPA-L3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SIPA1L3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPA-L3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPA-L3 em células tumorais com expressão de SIPA1L3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.