Plásmido CRISPR de Activación (h) SmcY: sc-403217-ACT

KDM5D codifica la desmetilasa de lisina SmcY (JARID1D), ligada al cromosoma Y, un regulador de la cromatina que elimina las marcas H3K4me2/3 para modular programas transcripcionales. A través de su función en el control epigenético, SmcY contribuye al mantenimiento de la identidad celular, a la regulación de la expresión génica asociada a la proliferación y a la coordinación del estado de la cromatina con procesos dependientes del ADN como la replicación y la reparación. La alteración de la actividad de la familia KDM5 se ha implicado en redes transcripcionales desreguladas en contextos de cáncer y del desarrollo, y KDM5D en particular se estudia con frecuencia en relación con la biología específica del sexo y la pérdida del cromosoma Y en tejidos somáticos. Estas características hacen de KDM5D un modelo útil para investigar cómo la desmetilación de histonas moldea las salidas de las vías y los fenotipos celulares.

SmcY El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KDM5D sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SmcY El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KDM5D en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KDM5D, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SmcY. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KDM5D y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SmcY en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SmcY en células tumorales con expresión de KDM5D silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.