Six3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404026-ACT

O SIX3 humano codifica o fator de transcrição homeobox Six3, um regulador mestre do padrão da placa neural anterior e do desenvolvimento inicial do prosencéfalo e dos olhos. O Six3 atua como uma proteína de ligação ao DNA específica de sequência que coordena programas transcricionais que controlam a proliferação de progenitores, a diferenciação neuronal e a identidade regional, com ligações bem estabelecidas à regulação cruzada das vias de sinalização Wnt/β-catenina e Sonic hedgehog (SHH) durante o neurodesenvolvimento. Alterações na dosagem ou na atividade regulatória do SIX3 estão associadas a malformações congênitas, incluindo holoprosencefalia e defeitos do desenvolvimento ocular, tornando-o um nó valioso para o estudo de redes regulatórias gênicas do desenvolvimento. Em modelos baseados em células, a perturbação de SIX3 é usada para investigar transições de estado da cromatina, lógica de enhancers e dinâmicas de especificação de linhagem relevantes para a biologia do neurodesenvolvimento.

Six3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SIX3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Six3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SIX3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SIX3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Six3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SIX3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Six3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Six3 em células tumorais com expressão de SIX3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.