Rubicon Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-432438-ACT

O gene murino 1700021K19Rik codifica a Rubicon (proteína contendo domínio RUN e domínio rico em cisteína, interatora de Beclin 1), um regulador do tráfego de membranas que modula a autofagia e a maturação endolisossomal. A Rubicon é mais conhecida por limitar a fusão entre autofagossomos e lisossomos por meio de interações com o complexo PI3K de classe III Beclin 1–VPS34 e por influenciar a fagocitose associada a LC3, moldando assim a degradação lisossomal, a inflamação e as respostas celulares ao estresse. Ao controlar o fluxo pelas vias de autofagia e fagocitose, a Rubicon pode afetar o controle de qualidade mitocondrial, a defesa antimicrobiana e programas de produção de citocinas relevantes para a neurodegeneração, a disfunção metabólica e patologias mediadas pelo sistema imune. Essas funções fazem da Rubicon um alvo útil para dissecar como o tráfego vesicular e a renovação dependente de lisossomos governam a homeostase em diversos tipos celulares de camundongo.

Rubicon O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de 1700021K19Rik sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rubicon O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus 1700021K19Rik em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição 1700021K19Rik, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rubicon. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus 1700021K19Rik nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rubicon no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rubicon em células tumorais com expressão de 1700021K19Rik silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.